Doppia risonanza elettrone-elettrone (DEER) nell'analisi della struttura del DNA - Applicazioni EPR (ESR).

Dagli anni '50, quando Watson e Crick proposero la classica struttura a doppia elica del DNA, il DNA è stato al centro della ricerca nelle scienze della vita. Il numero delle quattro basi nel DNA e il loro ordine di disposizione portano alla diversità dei geni, e la loro struttura spaziale influenza l'espressione genica.

Oltre alla tradizionale struttura a doppia elica del DNA, gli studi hanno identificato una speciale struttura del DNA a quattro filamenti nelle cellule umane, il G-quadruplex, una struttura di alto livello formata dal ripiegamento del DNA o dell'RNA ricca di ripetizioni in tandem di guanina (G ), che è particolarmente elevato nelle cellule G-quadruplex che si dividono rapidamente sono particolarmente abbondanti nelle cellule che si dividono rapidamente (ad esempio, le cellule tumorali). Pertanto, i G-quadruplex possono essere utilizzati come bersagli farmacologici nella ricerca antitumorale. Lo studio della struttura del G-quadruplex e della sua modalità di legame agli agenti leganti è importante per la diagnosi e il trattamento delle cellule tumorali.

Rappresentazione schematica della struttura tridimensionale del G-quadruplex.
Fonte immagine: Wikipedia

Doppia risonanza elettrone-elettrone (DEER)

Il metodo EPR dipolare pulsato (PDEPR) è stato sviluppato come uno strumento affidabile e versatile per la determinazione della struttura nella biologia strutturale e chimica, fornendo informazioni sulla distanza su scala nanometrica mediante tecniche PDEPR. Negli studi sulla struttura del G-quadruplex, la tecnica DEER combinata con l'etichettatura spin site-directed (SDSL) può distinguere dimeri G-quadruplex di diverse lunghezze e rivelare il modello di legame degli agenti leganti G-quadruplex al dimero.

Differenziazione di dimeri G-quadruplex di diverse lunghezze utilizzando la tecnologia DEER

Utilizzando Cu(piridina)4 come etichetta di spin per la misurazione della distanza, il complesso planare tetragonale Cu(piridina)4 è stato legato covalentemente al G-quadruplex e alla distanza tra due Cu2+ paramagnetici nel monomero quaternario G π-stacked è stato misurato rilevando le interazioni dipolo-dipolo per studiare la formazione del dimero.

[Cu2+@A4] (TTLGGG) e [Cu2+@B4] (TLGGGG) sono due oligonucleotidi con sequenze diverse, dove L indica il ligando. I risultati DEER di [Cu2+@A4]2 e [Cu2+@B4]2 sono mostrati nella Figura 1 e nella Figura 2. Dai risultati DEER, si può ottenere che nei dimeri [Cu2+@A4]2, la distanza media dei singoli Cu2+ -Cu2+ è dA=2,55 nm, l'estremità G-quadruplex 3′ forma il dimero G-quadruplex mediante impilamento coda-coda e l'asse gz di due etichette di spin Cu2+ nel dimero G-quadruplex è allineato parallelamente.

La distanza di impilamento [Cu2+@A4]2 π è maggiore (dB-dA = 0,66 nm) rispetto ai dimeri [Cu2+@A4]2. È stato confermato che ciascun monomero [Cu2+@B4] contiene un tetramero G aggiuntivo, un risultato che è pienamente in accordo con le distanze previste. Pertanto, le misurazioni della distanza mediante la tecnica DEER possono distinguere dimeri G-quadruplex di diverse lunghezze.

Fig. 1 (A) Lo spettro differenziale EPR pulsato (linea nera) del dimero [Cu2+@A4]2 e la sua corrispondente simulazione (linea rossa) (34 GHz, 19 K); (B) Dopo la correzione del fondo, quattro fasi nella mappa del dominio temporale ad DEER della posizione del campo (linea nera) e il miglior risultato di adattamento ottenuto da PeldorFit (linea rossa); (C) Distribuzione della distanza ottenuta utilizzando PeldorFit (linea rossa) e simulazione MD (linea grigia); (D) Equilibrio [Cu2+ tra il monomero @A4 e il dimero [Cu2+@A4]2. (Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 4939-4947)

Fig. 2 (A) Diagrammi DEER nel dominio del tempo (linee nere) in quattro posizioni del campo e dopo la correzione del fondo [Cu2+@B4]2 e i migliori risultati di adattamento ottenuti da PeldorFit (linee rosse); (B) [Cu2+@B4]; (C) Distribuzione della distanza ottenuta utilizzando PeldorFit (linea rossa) e simulazione MD (linea grigia). (Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 4939-4947)

Sondaggio della modalità di legame dell'agente legante G-tetramero al dimero utilizzando la tecnica DEER

Molte piccole molecole e complessi metallici, con sistemi coniugati aromatici planari e cariche positive, possono legare e stabilizzare strutture secondarie ripiegate, diventando così potenziali farmaci antitumorali.
N, N '-bis[2-(1-piperidinil)etil]3,4,9,10-perilenetetracarbossidicarbonil cloridrato (PIPER) è un noto agente legante G-quadruplex che può legarsi e stabilizzare il quadruplex mediante impilamento, e la modalità di legame di PIPER al G-quadruplex può essere studiata mediante la tecnica DEER.

La Figura 3 e la Figura 4 mostrano i risultati degli esperimenti DEER con diversi rapporti dimeri PIPER/[Cu2+@A4]2. I risultati mostrano che quando il rapporto PIPER/dimero [Cu2+@A4]2 è 1:1 (PIPER@[Cu2+@A4]2), dP = 2,82 nm.
La maggiore distanza tra Cu2+-Cu2+ rispetto ai dimeri puri [Cu2+@A4]2 (dA = 2,55 nm) indica che PIPER forma un complesso sandwich con il dimero, con la molecola organica planare interposta tra le facce 3′ dei due G monomeri tetramerici. Quando il rapporto tra PIPER e il dimero [Cu2+@A4]2 è 2:1 (2PIPER@[Cu2+@A4]2), d2P = 3,21 nm.
Una distanza di impilamento π aggiuntiva rispetto al dimero PIPER@[Cu2+@A4]2 ( dP = 2,82 nm ) indica l'inserimento di due ligandi PIPER nel dimero G-tetramero disposto coda a coda. La tecnica DEER può rivelare una nuova modalità di legame dell'inserimento PIPER dell'agente legante del G-tetramero nel dimero del G-tetramero per formare complessi intercalati.

Fig. 3 (A) Spettri di dipolo DEER con diversi rapporti di PIPER e dimero [Cu2+@A4]2 (geff =2,061); (B) modulazione DEER con diversi rapporti di profondità del dimero PIPER e [Cu2+@A4]2; (C) Equilibrio del dimero [Cu2+@A4]2 e PIPER@[Cu2+@A4]2, 2PIPER@[Cu2+@A4]2, PIPER@[Cu2+@A4].
(Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 4939-4947)

Fig. 4 (A) Spettro nel dominio del tempo DEER di PIPER@[Cu2+@A4]2; (B) distribuzione della distanza PIPER@[Cu2+@A4]2 ottenuta utilizzando PeldorFit (linea rossa) e simulazione MD (linea grigia); (C) spettro nel dominio del tempo DEER di 2PIPER@[Cu2+@A4]2; (D) Distribuzione della distanza 2PIPER@[Cu2+@A4]2 ottenuta utilizzando PeldorFit (linea rossa) e simulazione MD (linea grigia).
(Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 4939-4947)

Spettrometro a risonanza paramagnetica elettronica a impulsi CIQTEK

Lo spettrometro di risonanza paramagnetica elettronica a impulsi CIQTEK EPR100 supporta la tecnologia di risonanza a doppia elettrone-elettrone e può essere utilizzato per studiare la localizzazione strutturale, l'interpretazione funzionale, i processi di movimento fisiologico e l'interpretazione del meccanismo d'azione di complesse proteine ​​di membrana, DNA, RNA, acidi nucleici-proteine complessi e molecole proteiche correlate che hanno ruoli chiave in varie malattie.

Spettrometro a risonanza paramagnetica a impulsi elettronici CIQTEK EPR100


Risultati dell'esperimento DEER di CIQTEK EPR100

Risultati sperimentali dopo l'elaborazione con DeerAnalysis