COSY vs TOCSY: comprendere le differenze chiave e come interpretare gli spettri

Per l'analisi strutturale di molecole organiche complesse e prodotti naturali, esperimenti di NMR a correlazione scalare omonucleare 2D sono tra gli strumenti più utili per risolvere le ambiguità causate dalla sovrapposizione dei segnali negli spettri 1D.

Tra i più ampiamente utilizzati ¹H-¹H esperimenti di correlazione, COSY e TOCSY rispondono a due domande diverse ma complementari.

COSY è utilizzato principalmente per tracciare la connettività locale protone-protone attraverso accoppiamenti J osservabili, mentre TOCSY estende il trasferimento di magnetizzazione attraverso una rete di accoppiamento continua e aiuta a identificare tutti i membri osservabili dello stesso sistema di spin.

In termini pratici, COSY aiuta a rispondere a "Quali protoni sono accoppiati tra loro?", mentre TOCSY aiuta a rispondere a "Quali protoni appartengono allo stesso sistema di spin?"

Questo articolo esamina i due esperimenti, dai principi della sequenza di impulsi all'interpretazione pratica dello spettro, spiegandone le differenze chiave e come possono essere utilizzati insieme nella spettroscopia NMR 2D.

1. Funzioni principali di COSY e TOCSY

COSY, o spettroscopia di correlazione, e TOCSY, o spettroscopia di correlazione totale, utilizzano entrambi l'accoppiamento scalare, o accoppiamento J, per fornire informazioni sulla correlazione protonica attraverso i legami chimici.

Tuttavia, il tipo di informazioni strutturali che sono progettati per rivelare è diverso.

Consideriamo una catena protonica accoppiata in modo continuo:

H1 → H2 → H3 → H4

COSY: Connettività di accoppiamento locale

COSY rileva principalmente accoppiamenti scalari direttamente osservabili tra coppie di protoni.

Le correlazioni più comuni derivano da ²J_HH e ³J_HH accoppiamenti, per esempio:

H1 ↔ H2
H2 ↔ H3
H3 ↔ H4

Queste correlazioni a coppie consentono ai ricercatori di costruire la connettività protonica locale passo dopo passo.

In altre parole, uno spettro COSY è particolarmente utile quando l'obiettivo è ricostruire la relazione sequenziale tra protoni vicini o altrimenti accoppiati in modo rilevabile.

Nota: le correlazioni COSY non sono limitate agli accoppiamenti a due e tre legami. Nei sistemi allilici, nei sistemi aromatici o in geometrie rigide di tipo W, un accoppiamento ⁴J sufficientemente forte, tipicamente superiore a circa 1,5 Hz, può anche generare un picco incrociato COSY. Pertanto, la presenza di un picco incrociato da sola non deve essere considerata come prova che due nuclei siano direttamente adiacenti nella struttura molecolare.

TOCSY: Assegnazione di un intero sistema di spin

Il TOCSY adotta un approccio diverso.

Attraverso il trasferimento di magnetizzazione lungo una rete accoppiata tramite J, i protoni all'interno dello stesso sistema di spin continuo possono diventare correlati anche quando due protoni specifici non mostrano un forte accoppiamento diretto l'uno con l'altro.

Il suo scopo principale non è quindi quello di determinare la connettività diretta di ogni coppia di protoni. Invece, il TOCSY viene utilizzato per identificare e raggruppare più protoni che appartengono allo stesso sistema di spin.

Per esempio, se H1, H2, H3 e H4 formano una rete di accoppiamento continua, la magnetizzazione può propagarsi attraverso la sequenza:

H1 → H2 → H3 → H4

Di conseguenza, le correlazioni tra membri più distanti del sistema possono apparire nello spettro TOCSY.

Nota: un sistema di spin consiste solitamente in un gruppo di nuclei collegati da un percorso continuo di accoppiamenti J sufficientemente forti. Se l'accoppiamento efficace tra le parti di una molecola diventa molto debole o è assente, il trasferimento di magnetizzazione può essere interrotto. Ciò può verificarsi quando i gruppi sono separati da un carbonio quaternario, da alcune disposizioni di eteroatomi o da geometrie con un angolo diedro vicino a 90°, dove l'accoppiamento diventa molto piccolo. Il risultato è la formazione di sistemi di spin relativamente indipendenti.

2. Principi della sequenza di impulsi

La differenza fondamentale tra COSY e TOCSY deriva dal modo in cui viene gestito il trasferimento di magnetizzazione dopo il periodo di evoluzione indiretta, t₁.

2.1 COSY

La sequenza di impulsi COSY di base può essere rappresentata come:

90° - t₁ - 90° - Acquisizione (t₂)

Il primo impulso a 90° ruota la magnetizzazione longitudinale nel piano trasversale.

Durante il t₁ periodo di evoluzione, sia lo spostamento chimico che l'accoppiamento J contribuiscono all'evoluzione della coerenza.

Il secondo impulso a 90° produce quindi un trasferimento di coerenza diretto.

La coerenza che rimane sul nucleo originale contribuisce al segnale diagonale durante il periodo di acquisizione t₂, mentre la coerenza trasferita a un nucleo accoppiato genera un picco incrociato.

La COSY convenzionale registra quindi principalmente relazioni di accoppiamento J diretto a coppie.

Nello spettro, queste correlazioni rappresentano comunemente protoni vicinali o protoni geminali legati allo stesso carbonio.

2.2 TOCSY

La TOCSY introduce un ulteriore periodo di mixing spin-lock dopo il periodo di evoluzione t₁.

Lo spin lock non è semplicemente un lungo impulso RF. Di solito viene implementato utilizzando treni di impulsi compositi come MLEV-17 o DIPSI-2.

Durante il tempo di mixing, questi impulsi compositi generano un mixing isotropo, consentendo alla magnetizzazione di propagarsi attraverso una rete di accoppiamento J continua.

La magnetizzazione si trasferisce prima tra protoni vicinali direttamente accoppiati e può poi continuare passo dopo passo attraverso il sistema:

H1 → H2 → H3 → H4

Questo meccanismo di relay consente alla TOCSY di correlare membri più distanti dello stesso sistema di spin.

Tempo di mixing nella TOCSY

La durata del periodo di spin-lock è indicata come tempo di mixing, ed è uno dei parametri più importanti che controllano la profondità del trasferimento di magnetizzazione nella TOCSY.

Tempo di mixing breve, ad esempio da 20 a 30 ms

Il trasferimento di magnetizzazione è appena iniziato. Le correlazioni sono dominate dai protoni accoppiati vicini, quindi lo spettro risultante può assomigliare a uno spettro COSY.

Tempo di miscelazione moderatamente lungo, ad esempio da 60 a 100 ms

Questo è un intervallo comunemente utile per molte piccole molecole e prodotti naturali. La magnetizzazione ha più tempo per propagarsi attraverso un sistema di spin continuo, consentendo ai membri più distanti di diventare correlati.

Tempi di miscelazione più lunghi

Più lungo non è sempre meglio.

Aumentare il tempo di miscelazione può consentire alla magnetizzazione di raggiungere parti più distanti della rete di accoppiamento, ma anche il rilassamento e gli effetti legati alla RF diventano sempre più importanti.

T₂ Il rilassamento può ridurre l'intensità del segnale, mentre il riscaldamento RF e altri effetti sperimentali possono contribuire alla perdita di segnale o all'allargamento delle linee. In alcune condizioni sperimentali e di sequenza di impulsi, periodi di miscelazione più lunghi possono anche aumentare gli effetti di rilassamento indesiderati o gli artefatti legati agli impulsi.

Per questo motivo, il tempo di miscelazione TOCSY ottimale dovrebbe essere selezionato in base alle dimensioni molecolari, alla topologia di accoppiamento, al comportamento di rilassamento e al sistema di spin di interesse.

3. Come interpretare gli spettri COSY e TOCSY

In uno spettro 2D ¹H-¹H, entrambi gli assi rappresentano gli spostamenti chimici dei protoni.

I segnali lungo la diagonale corrispondono alle risonanze osservate nello spettro NMR 1D ¹H convenzionale.

I picchi incrociati situati lontano dalla diagonale indicano che la magnetizzazione è stata trasferita tra due risonanze protoniche attraverso percorsi di accoppiamento scalare.

A seconda dell'esperimento, queste correlazioni possono rappresentare accoppiamenti diretti a coppie o connettività all'interno di un sistema di spin continuo.

Il seguente esempio utilizza l'n-butil acetato per illustrare l'interpretazione pratica degli spettri COSY e TOCSY.

3.1 COSY: Costruire la sequenza protonica passo dopo passo

Nell'n-butil acetato, il carbonio carbonilico non ha alcun protone legato.

Inoltre, non esiste alcun percorso di accoppiamento protonico continuo osservabile tra il gruppo metilico dell'acetile e la catena n-butilica.

La catena n-butilica può quindi essere analizzata utilizzando una strategia di tracciamento graduale.

• Iniziare con il segnale protonico a campo basso più isolato, H2 a circa 4,0 ppm.
• Seguire la linea orizzontale da H2 finché non si trova il picco incrociato H2 ↔ H3 a circa 1,6 ppm.
• Successivamente, tornare al segnale diagonale H3 e cercare la sua successiva correlazione vicina. Questo rivela l'H3 ↔ H4 picco incrociato a circa 1.4 ppm.
• Dall'H4, continuare con lo stesso processo per identificare la correlazione H4 ↔ H5 a circa 0.9 ppm.

Seguendo questi singoli picchi incrociati a coppie, la sequenza di connettività protonica locale può essere ricostruita passo dopo passo.

È importante notare che non vi sono correlazioni H2 ↔ H4 o H2 ↔ H5 significative nello spettro COSY.

Ciò illustra una delle differenze più importanti tra COSY e TOCSY. Il COSY rivela principalmente le relazioni di accoppiamento a coppie osservabili necessarie per costruire l'impalcatura protonica locale.

3.2 TOCSY: Utilizzo di un segnale di ancoraggio per identificare l'intero sistema di spin

Per uno spettro TOCSY acquisito con un tempo di miscelazione appropriato, può essere utilizzata una diversa strategia di interpretazione.

• Per prima cosa, selezionare una risonanza protonica isolata come segnale di ancoraggio. In questo esempio, l'H2 a circa 4.0 ppm è un ancoraggio conveniente perché è ben separato dagli altri segnali protonici.
• Successivamente, tracciare una linea orizzontale in corrispondenza dello spostamento chimico dell'H2.
• Lungo questa linea, il picco diagonale dell'H2 appare insieme ai picchi incrociati che correlano l'H2 con H3, H4 e H5.
• Al contrario, il protone metilico dell'acetile H1 non appare lungo questa traccia.

Questi segnali possono quindi essere assegnati allo stesso sistema di spin n-butile.

L'assenza dell'H1 da questa traccia indica che il gruppo metilico dell'acetile e i protoni del n-butile appartengono a sistemi di spin diversi in queste condizioni.

Questo approccio diventa particolarmente utile per molecole più complesse.

Nei peptidi, ad esempio, un segnale NH ammidico o un segnale α-H può essere utilizzato come ancoraggio. Negli oligosaccaridi, il protone anomerico H-1 è spesso un segnale di ancoraggio particolarmente utile.

In questi sistemi, molte risonanze protoniche intermedie possono sovrapporsi all'interno di una stretta regione di spostamento chimico. Un'assegnazione COSY graduale può quindi diventare difficile o può essere interrotta da una grave sovrapposizione spettrale. Il TOCSY può aiutare a superare questo problema consentendo alle correlazioni di estendersi attraverso la rete accoppiata, rendendo possibile classificare i segnali in sistemi di spin anche quando le singole risonanze intermedie sono difficili da distinguere.

4. COSY vs TOCSY: Differenze chiave in sintesi

COSY e TOCSY non sono quindi esperimenti in competizione.

Forniscono diversi livelli di informazioni strutturali e sono spesso più utili se interpretati insieme.

5. Domande frequenti

1. Un tempo di miscelazione TOCSY più lungo è sempre migliore?

No.

Per le piccole molecole convenzionali, 60-100 ms sono spesso un intervallo ragionevole per iniziare i test.

Per campioni più complessi, può essere utile acquisire due set di dati per il confronto, ad esempio un tempo di miscelazione breve da 20 a 30 ms e un tempo di miscelazione relativamente lungo di 80-100 ms.

Con un periodo di miscelazione breve, lo spettro è dominato dalle correlazioni tra protoni vicini. Un periodo di miscelazione più lungo può rivelare correlazioni più distanti all'interno dello stesso sistema di spin.

Il valore ottimale, tuttavia, dipende da diversi fattori sperimentali, tra cui l'accoppiamento J, il comportamento di rilassamento, il solvente, la temperatura, le prestazioni della sonda e la potenza RF. Il tempo di miscelazione dovrebbe quindi essere ottimizzato per lo specifico campione e obiettivo sperimentale piuttosto che semplicemente massimizzato.

2. Se non viene osservato alcun picco incrociato, possiamo concludere che due protoni non sono adiacenti o correlati?

No.

L'assenza di un picco incrociato visibile non significa necessariamente che due nuclei non siano correlati.

Per esempio, secondo la relazione di Karplus, alcuni angoli diedri possono ridurre significativamente la ³costante di accoppiamento J.

Un picco incrociato può anche essere difficile da osservare se si trova vicino alla diagonale ed è oscurato dalle code diagonali.

I protoni scambiabili possono subire un rapido scambio chimico, con conseguente significativo allargamento delle linee.

In TOCSY, un tempo di miscelazione troppo breve può anche impedire alla magnetizzazione di raggiungere i membri più distanti del sistema di spin.

Pertanto, una conclusione di "nessun accoppiamento" non dovrebbe basarsi solo su un picco incrociato mancante. L'interpretazione dovrebbe considerare anche i pattern di splitting 1D, i dati NMR 2D complementari e i parametri di acquisizione utilizzati per l'esperimento.

3. Quali sono i vantaggi degli esperimenti potenziati da gradiente come gCOSY e gTOCSY?

I gradienti di campo pulsato, o PFG, possono essere utilizzati per selezionare specifici percorsi di trasferimento di coerenza e sopprimere parte del rumore ₁ e degli artefatti t.

Rispetto ad alcuni esperimenti convenzionali a ciclo di fase, le sequenze potenziate da gradiente possono anche ridurre il numero di scansioni richieste.

La quantità effettiva di tempo risparmiato sullo strumento dipende dalla particolare sequenza di impulsi e dai parametri di acquisizione.

La selezione tramite gradiente, tuttavia, non può compensare problemi sperimentali fondamentali. Uno shimming scadente, una calibrazione imprecisa degli impulsi, una soppressione inadeguata del solvente o un campionamento insufficiente nella dimensione indiretta possono comunque compromettere la qualità spettrale. Una buona configurazione sperimentale di base rimane essenziale per ottenere spettri COSY e TOCSY affidabili.

Scegliere tra COSY e TOCSY nella pratica

COSY e TOCSY formano una delle combinazioni più utili nella spettroscopia NMR 2D.

COSY aiuta a stabilire quali protoni mostrano relazioni di accoppiamento J direttamente osservabili, rendendolo particolarmente utile per tracciare la connettività locale.

TOCSY aiuta a determinare quali protoni appartengono allo stesso sistema di spin, consentendo ai ricercatori di raggruppare risonanze correlate anche quando i singoli picchi intermedi si sovrappongono o i protoni distanti non mostrano una forte correlazione diretta.

La chiave è definire la domanda strutturale prima di selezionare l'esperimento.

Se l'obiettivo è tracciare una sequenza protonica locale, COSY è spesso il punto di partenza naturale. Se l'obiettivo è identificare i membri di un intero sistema di spin accoppiato, TOCSY può fornire le informazioni aggiuntive necessarie.

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Quando si interpretano spettri COSY o TOCSY, la parte più difficile spesso non è raccogliere più correlazioni, ma capire esattamente cosa ogni picco incrociato dice e cosa non dice.